Recombinant protein production in alcohol dehydrogenase 2 deficient strain of Pichia pastoris
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Dokuz Eylül Üniversitesi, İzmir Uluslararası Biyotıp ve Genom Enstitüsü, Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2022
Tezin Dili: İngilizce
Öğrenci: ERHAN ÇITAK
Eş Danışman: EZGİ EREK, EZGİ KARACA EREK
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Pichia pastoris, biyoteknoloji ve ilaç endüstrisi gibi birçok alanda rekombinant proteinlerin üretimi için yaygın olarak tercih edilen bir ökaryotik ekspresyon sistemidir. P. pastoris ile ilgili hem endüstriyel hem de araştırma amaçlı birçok çalışma olmasına ragmen, bu mayanın etanol metabolizması tam olarak anlaşılamamıştır. P. pastoris etanol metabolizmasındaki görevli ADH2 ve ADH900 genleri daha önceki çalışmalarda tanımlanmıştır. ADH2 geninin etanol tüketiminden sorumlu tek gen olduğu ve ADH900 geninin etanol üretiminden sorumlu olduğu belirlenmiştir. Etanol tarafından indüklenen ADH2 promotörünün, biyoreaktör ölçeğinde rekombinant protein üretiminde AOX1 ve GAP promotörlerinden daha güçlü bir promotör olduğu gösterilmiştir. Bu çalışmanın amacı, endüstriyel ölçekte etanol ilavesi olmaksızın ADH2 promotörü altında rekombinant protein üretimine uygun bir biyoproses geliştirmektir. Normoksik koşullarda limitli besleme (GLF) ve hipoksik koşullarda glukoz puls besleme (GPF) stratejileri, kesikli beslemeli fermantasyon prosesinde ksilanaz üretimi için etanol beslemesi ile karşılaştırılmıştır. GPF stratejisinde, etanol ve asetik asit seviyeleri toksik seviyelere yükseldiğinden biyokütle gelişimini ve ürün oluşumunu olumsuz etkilemiştir. GPF stratejisinde etanol besleme stratejisine kıyasla ürün veriminin sadece 15%'i elde edildi. Bununla birlikte GLF stratejisinde, etanol besleme stratejisinin ürün veriminin %60'ı elde edilmiştir. Bu da GLF stratejisinin endüstriyel üretimde GPF'ye kıyasla sürdürülebilir ve uygun olduğu sonucuna varılmıştır. Ayrıca P. pastoris'in etanol tüketim mekanizması daha geniş bir çerçevede incelenmiştir. Bu çalışmada ADH900'ün etanol üretiminin yanı sıra etanol tüketiminde de rolü olduğu ortaya konmuştur. P. pastoris'in her iki ADH geni silinen suşunda (Δadh2 and Δadh900) da bir miktar etanolün tüketildiği gösterilmiştir. Bu sonuç, etanol kullanımında rol oynayan başka gen(ler)in olabileceğini gösterir.