Matriks metalloproteinaz -1, -8 ve -13 aktivitelerinin belirlenmesi amacıyla kollajen zimografi yöntemi'nin standardizasyonu
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Dokuz Eylül Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Moleküler Tıp Ana Bilim Dalı, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2012
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: ŞENİZ İNANÇ
Danışman: GÜLGÜN OKTAY
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Giriş: Canlı organizmalarda bulunan matriks metalloproteinazlar (MMP'ler), aktif bölgelerinde Zn2+ atomu içeren endopeptidazlardır. MMP'ler başlıca kollajen, laminin gibi ekstrasellüler matriks (ESM) bileşenlerinin yanı sıra, büyüme faktörleri, reseptörler gibi ESM dışı moleküllerin degradasyonundan da sorumludurlar. Kollajenazlar olarak bilinen MMP-1,-8 ve-13; tip I-II-III-V ve IX doğal fibriler kollajeni yıkma yeteneğine sahip proteazlardır. MMP'lerin aynı jel üzerinde pro ve aktif formlarının düzeylerini belirlemede kullanılan Zimografi tekniği, SDS-PAGE tekniğine dayalı elektroforetik bir yöntemdir. Kullanılan substrata göre jelatin, kazein veya kollajen zimografi şeklinde adlandırılmaktadır.Amaç: Bu çalışmada; kollajen zimografi tekniğinin standardizasyonu sağlanarak kollajenazların (MMP-1, -8 ve -13) aktivitelerinin kantitasyonu ve kollajen zimografi tekniğinin laboratuvarımıza kazandırılması amaçlanmıştır.Yöntem: Kollajen zimografi yönteminde substrat olarak kullanılan tip I kollajen sıçan kuyruk tendonlarından ekstrakte edilerek saflaştırıldı. Bununla birlikte substratların spesifikliklerini karşılaştırmak amacıyla tip I ve II kollajen ticari olarak satın alındı. İnsan rekombinant kollajenazları kullanılarak kollajen zimografi tekniği standardize edildi. Her çalışma en az 6 defa tekrar edildi. Yapılan zimografi işleminin ardından jeller ?UVP Gel Logic System? ile görüntülendi, litik bantların yoğunlukları hesaplandı ve standart grafikleri çizildi.Bulgular: Veriler değerlendirildiğinde tüm kollajenazlar için en uygun substratın tip I kollajen olduğu belirlendi ve çalışmaya aynı zamanda düşük maliyeti nedeniyle saflaştırılmış tip I kollajen üzerinden devam edildi. En belirgin litik bantlar 48 saatlik inkübasyon sonucunda görüldü. Yapılan standardizasyon çalışmaları sonucunda kollajen zimografi tekniği ile en az 1 ng kollajenaz aktivitesinin saptanabildiği bulundu. Bu nedenle 1-100 ng aralığında rekombinant kollajenazlar kullanılarak standart grafikleri çizildi.Sonuç: Sonuç olarak; MMP-1, -8, -13'ün aktif ve pro formlarını ayrı ayrı deteksiyonunu sağlayan kollajen zimografi tekniği laboratuvarımıza kazandırılmıştır ve gelecekte yapılacak olan projelerimizde kullanmak üzere standart grafikleri oluşturulmuştur.