Korelatif mikroskop ile veziküler yapıların görüntülenmesi
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Dokuz Eylül Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2018
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: ŞEYDA DEMİR
Danışman: HÜSNÜ ALPER BAĞRIYANIK
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Korelatif mikroskop, optik mikroskoplar ile elektron mikroskoplarının birleştirildiği bir görüntüleme tekniğidir. En sık kullanılan kombinasyonu ışık mikroskopları ile elektron mikroskoplarının birleştirildiği sistemlerdir. Bu sistemlere kısaca CLEM (Correlative Light and Electron Microscopy) adı verilir. Işık mikroskobu olarak genellikle floresan mikroskoplar kullanılır. Floresan ile işaretli molekülleri görüntüleme özgünlüğüne sahip Floresan Mikroskop (FM) ile benzersiz yüksek çözünürlüğe sahip Elektron Mikroskobu (EM) nun birleştirilmesi ile biyolojik örneklerin yapı ve işlevini bir arada ve en yüksek çözünürlükte incelenmesini sağlar. Korelatif mikroskopi sisteminin geliştirilmesi ile, yapı ve fonksiyonda rol alan protein ve/veya RNAlar gibi moleküllerin, veziküllerin içinde veya yüzeyinde, yüksek çözünürlükte gösterilmesi mümkün olmuştur. Ancak halen bu sistemin metodolojik olarak geliştirilmesine ihtiyaç vardır.Çünkü korelatif mikroskopi benzersiz özellikleri yanında ciddi zorluklar da barındırır. Bunun en önemli nedeni FM ile EM için örnek hazırlama basamaklarının birbiri ile uyumlu olmamasıdır. Bu nedenle korelatif mikroskopi ile çalışmanın en büyük zorluğu örnek hazırlama sürecidir. Örnek hazırlama sürecinde hem floresan sinyalin kaybedilmemesi hem de ultra detaylı yapının korunması gereklidir. İki prosedür arasındaki denge en iyi şekilde kurulmalıdır. Diğer neden ise FM de işaretlenen ve görüntülenen alanın TEM de izinin sürülmesinin zor ve zaman alıcı bir işlem hatta bazen imkansız olmasıdır. Günümüzde yapılmakta olan çalışmalarda da Korelatif Mikroskopide görüntüleme için protokol geliştirme çalışmaları devam etmektedir. Ekzozomlar çift lipid tabakalı membran ile çevrili 30-150 nm çapında nano veziküllerdir. Eritrositler, lenfositler, dendritik hücreler ayrıca kanser hücreleri gibi birçok farklı hücre tipinden salınırlar. Tükürük, plazma, idrar, amniyotik sıvı,bronşiyal lavaj sıvısı, sinovyal sıvı, anne sütü gibi vücut sıvılarında bulunur ve bu sıvılardan izole edilebilirler. Hücreler arası haberleşmede yeni bir mekanizma olarak tarif edilen, yüksek biyobelirteç potansiyelleri nedeniyle özellikle hastalıkların tanısında ve yüklenebilir oldukları için tedavisinde kullanılabileceğine dair bir çok kanıt olan ekzozomların bilinmeyenleri de bir hayli fazladır. Bu nedenle, ekzozomların yüksek çözünürlükte işaretlenerek görüntülenmesi morfolojilerini ve fonksiyonlarını anlamak için oldukça önemli bir yöntemdir. İndirekt yöntemlerin aksine varlıkları, lokasyonları ve davranışları için kesin bir kanıttır. Amaç: Bu çalışmada, ekzozomlar kültür ortamındaki HeLa hücrelerden izole edilerek korelatif mikroskopi yöntemi ile görüntülenecektir. Şu anki literatür bilgimize göre daha önce ekzozomlar bu metot ile gösterilmemiştir. Yöntem: Hücre kültüründen izole ettiğimiz nano-boyutta veziküller olan ekzozomları, yüzey belirteci olan CD63 proteinini floresan konjuge antikorlar ile işaretleyerek konfokal mikroskopta görüntülenip, görüntülenen alanın koordinasyonları özel bir tututucu sayesinde, Zeiss ZEN Blue yazılım programı kullanılarak kaydedildikten sonra aynı örnek tututcuda ki pozisyonu hiç değiştirilmeden, elektron mikroskobik görüntüleme için kontrastlanarak EM de görüntülenir. Daha sonra bu iki görüntü arasında 3 tane korelasyon noktası belirlenir ve konfokalde işaretlenen alan bilgileri, ultra-detaylı elektron mikroskop görüntüsü üzerine, kaydededilen koordinasyonlar kullanılarak bire bir Zeiss Shuttle&Find programı ile yerleştirilir. Böylece korelasyon görüntüsü oluşturulur. Bulgular: Ekzozomlar yüzey belirteci olan CD63 proteininden floresan konjuge antikorlar ile işaretlenerek Konfokal-SEM ve Konfokal-TEM kombinasyonundan oluşan Korelatif Mikroskobi yöntemi ile görüntülenmiştir. Sonuçlar: Bu çalışma ile, hücrelerden izole edilen ekzozomlar ilk defa Korelatif Mikroskopi yöntemi ile görüntülenmiştir