Resveratrol ve Sirtuin1'in p53(+

Tezin Türü: Yüksek Lisans

Tezin Yürütüldüğü Kurum: Dokuz Eylül Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Moleküler Tıp Ana Bilim Dalı, Türkiye

Tezin Onay Tarihi: 2015

Tezin Dili: Türkçe

Öğrenci: GÜNEŞ ÖZEN

Danışman: AYŞE SEMRA KOÇTÜRK

Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu

Özet:

Giriş: Kanser birden fazla kompleks moleküler değişikliklerden oluşan heterojen bir hastalıktır. Resveratrol, 70'ten fazla bitki türü tarafından sentezlenen doğal bir polifenoldür. Günümüzde resveratrolün anti-kanserojen etki gösterdiği ve çeşitli kanser hücreleri üzerinde anti-proliferatif ve apoptozu indükleyici etkilerinin olduğu bilinmektedir. Resveratrol ile ilgili yapılan son araştırmalar incelendiğinde; resveratrolün bir histon deasetilaz enzimi olan sirtuin1(SIRT1) aktivitesini arttırdığı belirlenmiştir. SIRT1'in tümör baskılayıcı molekül olan p53'ü deasetile ettiği de bilinmektedir. p53 mutasyonu kanser olgularının %50'sinden fazlasında görülmektedir; ancak teröpatik ajanların veya polifenollerin kanser hücrelerindeki etkileri çok farklı olabilmektedir. Bunun yanı sıra, kolon kanser hücrelerinde artmış SIRT1 ekspresyonu olduğu da bildirilmektedir. Resveratrolün SIRT1 ekspresyonu ve sinyal ileti yolakları üzerindeki etkileri düşünüldüğünde, kolon kanser hücrelerinin p53 mutasyonu taşıyıp taşımadığı önem kazanmaktadır. Yapılan literatür çalışmasında resveratrolün p53 varlığı ve yokluğunda kolon kanser hücrelerindeki sinyal ileti yolaklarına etkileri ve SIRT1 ilişkisine yönelik yeterli bilgi bulunamamıştır. Amaç: Bu çalışmada amacımız, p53(+/+) ve p53(-/-) kolon kanser hücrelerinde resveratrolün SIRT1 aktivasyonu ve inhibisyonu şartlarında hücre canlılığı, apoptotik hücre ölümü ve çeşitli sinyal ileti yolakları üzerindeki etkilerinin incelenmesidir. Materyal ve Yöntem: HCT116p53(+/+) ve HCT116p53(-/-) kolon kanser hücrelerinde resveratrolün ve SIRT1 inhibitörü olan sirtinolün hücre canlılığına etkisi ve IC50 dozları WST-1 analizi ile değerlendirildi. IC50 dozlarında resveratrol ve sirtinol ile 24 ve 48 saat inkübasyon süresinde gerçekleşen hücre ölüm tipi (apoptotik/nekrotik) akış sitometrik Annexin-V/PI yöntemi ile incelendi. SIRT1 enzim aktivitesi fluorometrik aktivite kiti kullanılarak değerlendirildi. Hücre hatlarında SIRT1 ve p53 protein ekspresyon düzeyleri Western Blot yöntemi ile belirlendi. TGFβ, WNT, p53, NFκB ve JAK/STAT yolaklarında bulunan 29 adet gen ekspresyon değişimi Gerçek Zamanlı PZR Yöntemi ile tüm deney gruplarında incelendi. Elde edilen veriler Student's t testi ile istatistiksel analizi yapılarak p<0.05 anlamlılık düzeyinde resveratrolün sinyal ileti yolaklarındaki gen ekspresyonları üzerindeki etkileri, SIRT1 aktivitesi ve p53 bağımlılığı değerlendirildi. Bulgular: HCT116p53(+/+) ve HCT116p53(-/-) kolon kanser hücrelerinde resveratrolün IC50 değeri 48 saat için 60 µM olarak belirlendi. HCT116p53(+/+) hücrelerinde belirlenen, IC50 dozundaki resveratrolün apoptotik hücre ölüm yüzdesi akış sitometrik analizde 24 saatte %34.9; 48 saatte %45.7 ve HCT116p53(-/-) hücrelerinde apoptotik hücre yüzdesi 24 saatte %27.4 oranında, 48 saatte %40 oranında saptandı. SIRT1 aktivite analizine göre, HCT116p53(+/+) hücrelerinde sirtinol uygulaması ile SIRT1 inhibisyon dozu ve süresi sırasıyla 80 µM ve 24 saat olarak belirlendi. HCT116p53(+/+) hücrelerinde yapılan hücre canlılık analizinde, 24 saat 60 µM resveratrol uygulaması ile %40.4 oranında, sirtinol ve resveratrolün ardışık 24'er saat uygulanması ile hücre canlılığında %57.3 oranında azalma belirlendi. Aynı şekilde, HCT116p53(-/-) hücrelerinde 24 saat resveratrol uygulaması ile %43.6 oranında, ardışık uygulama ile canlılıkta %59.6 oranında azalma belirlendi. HCT116p53(+/+) hücrelerinde resveratrol uygulaması ile %27.6, 24'er saat sirtinol ve resveratrolün ardışık uygulanması ile %33.4 oranında apoptotik hücre yüzdesi belirlendi. Aynı şekilde HCT116p53(-/-) hücrelerinde, resveratrol uygulaması ile %17.9, ardışık uygulama ile %18.2 oranında apoptotik hücre yüzdesi saptandı. Sirtinol ve resveratrolün ardışık olarak uygulandığı HCT116p53(+/+) hücrelerinde SIRT1 protein ekspresyon düzeyinin kontrole göre p<0.05 düzeyinde anlamlı olarak azaldığı belirlendi. HCT116p53(-/-) hücrelerinde ise anlamlı bir fark saptanmadı. Deney gruplarında yapılan gen ekspresyon analizleri sonucunda resveratrolün, kolon kanser hücrelerinin p53 mutasyonu ve SIRT1 aktivite düzeyine bağlı olarak proliferatif ve apoptotik etki gösterebilen birçok gen üzerinde istatistiksel olarak anlamlı değişim oluşturduğu saptandı. Sonuç: Yapılan bu araştırma ile resveratrolün (60 µM) HCT116p53(+/+) ve HCT116p53(-/-) kolon kanser hücrelerinde hücre canlılığını etkilediği ve apoptotik hücre ölümüne yol açtığı saptanmıştır. Bununla birlikte araştırmamızın verileri hücrelerin p53 mutasyonu ve SIRT1 aktivite düzeylerine göre değerlendirildiğinde; resveratrol (60 µM) uygulamasının hem apoptotik etki hem de gen ekspresyonu düzeyinde farklı değişimlere neden olduğu ilk kez belirlenmiş oldu. Kolon kanser hücrelerinde resveratrolün p53 ve SIRT1 aktivitesine göre proliferatif ve/veya apoptotik etki gösterebileceğini öngörmekteyiz. Sonuç olarak kolon kanser hastalarında bilinçsiz resveratrol kullanımının farklı etkiler yaratabileceğini öngörmekteyiz. Anahtar Sözcükler: Kolon kanseri, Resveratrol, SIRT1, p53, Apoptoz, Sinyal ileti yolakları