Akademik Veri Yönetim Sistemi
Tezin Türü: Tıpta Uzmanlık
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Dokuz Eylül Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2006
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: HARUN AĞCA
Danışman: AYÇA ARZU SAYINER
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:1. ÖZET Gerçek zamanlı polimeraz zincir tepkimesi ile HBV DNA kantitasyonu ve HBV DNA YMDD motif mutasyonu analizi Dr. Harun Ağca Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji A.D. İnciraltı/ İzmir Anahtar sözcükler: HBV, lamivudin direnci, YMDD, gerçek zamanlı PZT, erime ısısı Hepatit B virusu, dünya nüfusunun üçte birinin karşılaştığı önemli bir sağlık sorunu etkenidir. Etkenle yenidoğan döneminde karşılaşanların %90'da, erişkin yaşta karşılaşanların % 5-10'unda kronik infeksiyon gelişmekte ve bu hastalar siroz, hepatosellüler karsinom gibi komplikasyonlar açısından yüksek risk taşımaktadırlar. Nükleozit analogları, kronik B hepatiti tedavisinde kullanılan ajanlar arasında önemli bir yer tutmaktadır. Günümüzde bu grup içerisinde en yaygın kullanılan ilaç lamivudindir. Ancak lamivudin ile tedavi sırasında viral polimeraz geninde yer alan ve enzimin YMDD motifinin ikinci aminoasidinde değişikliğe yol açan mutasyonlar gelişerek ilaca karşı dirence yol açmaktadır. Lamivudine direnç gelişmesi, tedavi başarısızlığına ve karaciğer hasarında alevlenmeye yol açmaktadır. Bu nedenle lamivudin kullanan hastalarda direnç gelişiminin izlenmesi ve gereğinde ilaç değişikliğine gidilmesi önerilmektedir. Lamivudin direncinin genotipik yöntemlerle belirlenmesinde, sıklıkla, dizi analizi, LIPA yöntemi, restriksiyon enzim fragman analizi ("RFLP") ve gerçek zamanlı PZT yöntemleri kullanılmaktadır. Çalışmamızın amacı, aynı testte HBV DNA kantitasyonu ve YMDD motif analizini sağlayacak gerçek zamanlı PZT yöntemi geliştirilmesidir. "Bi-probe" yöntemine dayalı gerçek zamanlı PZT ve erime ısısı analizi kullanılmıştır. Bu amaçla bir adet Cy5 ile işaretli hibridizasyon probu kullanılmış ve PZT karışımına SYBR Green boyası eklenmiştir. Testin optimizasyonu ve yabanıl / mutant viruslara özgü erime ısılarının belirlenmesinde YMDD, YVDD, 1YIDD motifleri ile uyumlu diziler taşıyan klonlanmış ürünler kullanılmıştır. Erime ısısı analizi, prob üzerindeki Cy5 boyası ile çift sarmala bağlanan SYBR Green arasındaki enerji transferine ("Flourescent resonance energy transfer" FRET) dayalıdır. YMDD, YIDD ve YVDD için elde edilen farklı erime tepe noktalan (Tm), yabanıl / mutant dizilerin ayırd edilebilmesini sağlamıştır. Gerçek zamanlı PZT ile HBV DNA kantitasyonu için kalite kontrol serumlarına (VQC, Hollanda) dayalı eksternal kantitasyon eğrisi yöntemi kullanılmış ve testin kantitasyon aralığı 3x1 03 ile 3xl07 kopya/ml olarak belirlenmiştir. Geliştirilen testin, serum örnekleri ile değerlendirilebilmesi için Dokuz Eylül Üniversitesi Hastanesi'nde kronik B hepatiti nedeniyle izlenen ve lamivudin kullanmakta olan yirmi bir hastaya ait otuz dokuz serum örneği incelenmiştir. Örneklerdeki YMDD motif dizisi ticari LIPA testi ve dizi analizi ile belirlenmiştir. Aynı örnekler, geliştirilen gerçek zamanlı PZT ve erime ısısı analizi ile de incelenerek, erime ısısı analizinin diğer iki yöntemle uyumu değerlendirilmiştir. Ortalama erime tepe noktası ışılan, YMDD için 59.29 °C, YVDD için 55.11 °C, YIDD için 52.91 °C olarak belirlenmiştir. Yöntemde kantitasyonun alt sının olan 3000 kopya/ml seviyesinin üzerinde HBV DNA içeren örneklerde YMDD motif mutasyonu saptama açısından duyarlılık, dizi analizine göre değerlendirildiğinde % 88, LIPA yöntemine göre değerlendirildiğinde % 83 olarak belirlenmiştir. Örneklerdeki HBV DNA kantitasyonu ticari bir test (RealArt HBV DNA RG, Artus, Almanya) ve geliştirilen gerçek zamanlı PZT ile yapılmış ve sonuçlar birbiri ile uyumlu bulunmuştur. Geliştirilen gerçek zamanlı PZT ve erime ısısı analizinin, duyarlılığı yüksek, minör virus populasyonlan dışında LIPA ve dizi analizi ile uyumlu, kolay uygulanabilir, hızlı, ekonomik ve YMDD mutasyon analizi ile HBV DNA kantitasyonunu aynı çalışmada belirleyebilen bir yöntem olduğu belirlenmiştir. Yöntemin geliştirilebilir yönleri olmakla birlikte HBV DNA kantitasyonu ve YMDD mutasyon analizi yapan, örnek sayısı yüksek laboratuvarlarda kullanıma uygun olduğu düşünülmektedir.