Akademik Veri Yönetim Sistemi
Tezin Türü: Tıpta Uzmanlık
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Dokuz Eylül Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2006
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: GÜLİZ DOĞAN
Danışman: AYÇA ARZU SAYINER
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:l.ÖZET influenza A ve B Virus RNA' sının RT-PZT Yöntemiyle Saptanması Dr. Güliz Doğan Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji AD İnciraltı/İzmir Amaç ve Hipotez: Influenza virus, akut solunum sistemi infeksiyonlarına neden olan viral ajanlar arasında sık görülenlerden ve salgınlara yol açan etkenlerden biridir. Bu infeksiyonu klinik olarak diğer solunum sistemi patojenlerinin yaptığı solunum sistemi infeksiyonundan ayırmak zordur, influenza virusların erken tanısı klinik ve epidemiyolojik açıdan önemlidir. Tedavi ve riskli kişilerin korunması için kullanılan antiviral ajanlar, semptomlar başladıktan sonra en geç 24-48 saat içerisinde alınırsa klinik yarar sağlamaktadır. Ayrıca, erken tanı ile gereksiz tetkikler, gereksiz antibiyotik tedavisi önlenerek ve hastanede kalış süresi azaltılarak maddi tasarruf sağlanabilmekte, antibiyotik kullanımının neden olduğu yan etkiler ve direnç sorunları önlenebilmektedir. Çalışmada, influenza virusların hızlı, duyarlı ve özgül tanısını sağlayacak, rutin kullanıma uygun gerçek zamanlı RT-PZT esaslı bir yöntem geliştirilmesi amaçlanmıştır. Yöntem: Akut solunum yolu infeksiyonu tanısı alan olgulardan nazofarenjial sürüntü örnekleri toplandı. Olgular, İzmir Bahçelievler semtinde bulunan Kılıçreis Sağlık Ocağı'na başvuranlardan veya Dokuz Eylül Üniversitesi çalışanlarından seçildi. Toplanan 191 örneğin, 101 tanesi Aralık 2003- Mart 2004, 90 tanesi Ekim 2004- Nisan 2005 tarihleri arasında alındı. Hastaların, 44'ünü çocuklar (ortalama yaş: 74.9 ay; 2-192 ay arası), 147'sini erişkinler (ortalama yaş: 42.7 yaş; 17-80 yaş arası) oluşturdu. Hastalar, ani başlayan yüksek ateş, miyalji, baş ağrısı, halsizlik, nonprodüktif öksürük, boğaz ağrısı, burun akıntısı veburun tıkanıklığı yakınmaları açısından sorgulandı. Bu semptomlardan en az üç tanesinin birlikteliği akut solunum yolu infeksiyonu olarak kabul edildi. Sürüntüler, viral transport besiyerinde + 4°C'de taşındı ve alikotlanarak test uygulanana kadar -80°C'de saklandı. RNA izolasyonu High Pure Viral RNA kit (Roche Diagnostics, Germany) ile yapıldı, influenza A ve B RNA tespiti için iki yöntem kullanıldı. Birincisi, RT-PZT ve sonrasında uygulanan plak hibridizasyon - EIA yöntemine dayanan ticari bir kit (Influenza A/B typing OligoDetect, Chemicon International, USA) ikincisi, Schweiger ve ark. çalışması kaynak alınarak geliştirilen gerçek zamanlı RT-PZT testi idi [97]. Gerçek zamanlı RT-PZT testinde, influenza A ve B için ayrı öncül çiftleri ve hidrolize olan problar (TaqMan probu) kullanıldı. Test, influenza A ve B için ayrı ayrı çalışıldı. Ayrıca ilk yıl toplanan 12 ve ikinci yıl toplanan tüm örnekler hücre kültürü yapılması amacıyla kuru buz üzerinde İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi Viroloji Laboratuvan'na gönderildi. Her iki RT-PZT'de standardizasyon ve optimizasyon için hücre kültüründe üretilmiş influenza A ve B viruslarından elde edilen RNA kullanıldı. Chemicon RT-PZT testi için, ELA indeksi (örnek OD/cutoff OD) iki ve üstü olan örnekler pozitif kabul edildi. Bulgular: Çalışılan 191 örneğin:. RT-PZT sonrası plak hibridizasyon testiyle: 23'ünde (20'si 2003-2004, 3'ü 2004-2005 sezonunda) influenza A, 4'ünde (hepsi 2004-2005 sezonunda) influenza B RNA' sı tespit edildi. RT-PZT pozitif saptanan örneklerden 17/30'ünde (% 56.6) agaroz jel elektroforezinde de bant saptanırken, 13'ü (% 43.4) sadece hibridizasyon ile tespit edildi. Bir örnekte influenza B virus ile uyumlu bant saptanırken, plak hibridizasyon testi negatif sonuç verdi.. Gerçek zamanlı RT-PZT yöntemiyle: 40'mda (31'i 2003-2004, 9'u 2004-2005 sezonunda) influenza A RNA' sı tespit edildi. Bu yöntemle örneklerin hiçbirinde influenza B virus RNA' sı tespit edilemedi. Amplifikasyonun değerlendirilebilmesi için gerçekleştirilen jel elektroforezinde beş örnekte influenza B ile uyumlu pozitif bant saptandı.influenza virus izolasyonu için hücre kültürü yöntemiyle incelenen 1 02 örneğin;. 13 'ünde influenza A virus (10'u 2003-2004, 3'ü 2004-2005 sezonunda), 13 'ünde influenza B virus (hepsi 2004-2005 sezonunda) üretildi. Sonuç:. Çalışmada kullanılan gerçek zamanlı RT-PZT yöntemi, influenza A virus infeksiyonu tanısında kullanılabilecek hızlı ve güvenilir bir tanı metodu olarak bulunmuştur. Klasik RT-PZT yöntemine göre daha hızlı ve tek tüpte, tüp açılmadan gerçekleştirildiği için kontaminasyon riski daha düşüktür. Her iki RT-PZT yönteminde de internal kontrol kullanılmadığından yalancı negatiftik olasılığı dışlanamamıştır.. "Chemicon" RT-PZT yönteminde, pozitif örneklerin yaklaşık olarak 1/3 'ü, ancak plak hibridizasyonu ile saptanmıştır. Plak hibridizasyon basamağı, testin duyarlılığı arttırmıştır.. Influenza B virus için gerçekleştirilen gerçek zamanlı RT-PZT yönteminde, bazı örneklerde amplikonların agaroz jel elektroforezi ile gösterilebilmesi ancak prob hibridizasyonu ile saptanamaması, hibridizasyonda sorun olduğunu göstermiştir. Bu sorun, eksternal kalite kontrol örnekleri ve kültür izolatları ile ortaya çıkmamıştır. Benzer bir sorun "Chemicon" testi ile de bir örnekte saptanmıştır. Amplikon saptanabilen örneklerin dizi analizi ile incelenmesi ve sorunun hedef dizilerdeki değişikliklerden kaynaklanıp kaynaklanmadığının belirlenmesi planlanmıştır.. Çalışma grubunda, 2003-2004 sezonunda, sadece influenza A virus saptanmış ve Ocak ayında artış gösteren infeksiyona yol açtığı belirlenmiştir. 2004-2005 sezonunda ise influenza A virusa ek olarak influenza B virus olgularının da varlığı belirlenmiştir, influenza A virüsün Ocak ayında artan infeksiyon yaptığı, takip eden Şubat ve Mart aylarında ise influenza B virüsün baskın olarak hastalık oluşturduğu görülmektedir.