Akademik Veri Yönetim Sistemi
Tezin Türü: Tıpta Uzmanlık
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Dokuz Eylül Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2009
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: GÜNEŞ ÖZÇOLPAN
Danışman: AYÇA ARZU SAYINER
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Hepatit B virusu, dünyada iki milyar kişinin karşılaştığı, bunların 400 milyonunda kronik enfeksiyona yol açmış önemli bir enfeksiyon etkenidir. Ülkemiz, ortalama %5'lik (bölgelere göre %1 - 14,3 arasında değişmektedir) HBsAg pozitifliği ile orta endemisite ülkeleri arasında yer almaktadır.HBV infeksiyonunun virolojik tanısı ve izlenmesi, özgül antikorların, antijenlerin ve nükleik asidin saptanması ve nükleik asitin kantitasyonu ile yapılmaktadır. HBV DNA'nın kanda gösterilmesi aktif HBV infeksiyonunun güvenilir bir göstergesidir ve infeksiyon tanısında, evrelendirilmesinde, tedaviye karar vermede ve tedavi başarısının izlenmesinde önemli rol oynamaktadır. HBV DNA, HBsAg'den 3-5 hafta önce kanda saptanabildiği için erken tanıda önemli bir parametredir ve kan bankacılığında, donor taramasında kullanımı gündeme gelmiştir.Günümüzde HBV DNA saptamada, sıklıkla, nükleik asit amplifikasyon testlerinden olan PZT esaslı testler kullanılmaktadır. Kalitatif konvansiyonel PZT testlerine bakıldığında, duyarlılıklarının yüksek olması, tekrarlanabilirliklerinin düşük olması, ?carryover? kontaminasyon oranlarının yüksek olması gibi nedenlerle kullanımları sınırlıdır. Gerçek zamanlı PZT yönteminde amplifikasyon sırasında saptama yapıldığından kontaminasyon riski, klasik PZT yöntemine göre daha azdır. Ayrıca amplifikasyon sırasında her döngüde prob sinyali ölçülerek, eşik değeri aşan döngüye (ct) göre kantitatif değer belirlendiğinden, gerçek zamanlı PZT yöntemiyle, klasik PZT yöntemine göre daha doğru kantitatif sonuçlar elde edilebilmektedir. Dinamik aralığının geniş olması da gerçek zamanlı PZT yönteminin avantajlı yönlerindendir. Böylece kanda geniş bir aralıkta saptanabilen HBV DNA'nın (> 9 logaritma) takibi yapılabilmektedir.Bu çalışmada, rutin hasta hizmetinde kullanılabilecek, maliyeti ticari testlerden daha düşük, gerçek zamanlı PZT yöntemiyle HBV DNA kantitasyonu yapabilen, internal kontrol içeren, tüm HBV genotiplerini saptayabilen ve ticari kitlerin performansına sahip bir test geliştirilmesi hedeflenmiştir.Çalışmamızda internal kontrol olarak, insanlarda enfeksiyon yapmayan, zarflı bir DNA virusu olan, hücre kültüründe üretilmiş bovin herpes virus tip 1 (BHV-1) kullanılmış ve örneğe ekstraksiyondan önce eklenmiştir. Böylece yalancı negatifliğe yol açabilecek ekstraksiyon ve amplifikasyon basamaklarındaki sorunlar izlenebilmiştir.Standart olarak kullanılmak üzere, tez primerleriyle elde edilen ürünü taşıyan plazmid oluşturulmuş ve Escherichiae coli' de çoğaltılmıştır. Absolü kantitasyon yöntemi kullanılan testte, her çalışmaya alınan beş adet plazmid dilüsyonu ile elde edilen standart eğri kullanılmıştır.Yeni testin dinamik aralığı 5x101 - 5x1010 IU/ml ve en düşük saptama sınırı 48 IU/ml (32 ? 129) olarak saptanmıştır. Bu parametreler, HBV infeksiyonu tanısı ve izlemi için uygun bulunmuştur.Testin tekrarlanabilirliği sonuçların güvenilirliği ve hasta izleminde anlam ifade edecek değişiklik miktarının belirlenmesinde önemlidir. Ct değerleri üzerinden yapılan değerlendirmede, yeni testte % CV değerleri, test içi değerlendirmede % 0,7 - % 4,1; testler arası değerlendirmede % 0,3 - % 1,9 olarak saptanmıştır. Bu değerler ticari testlerle karşılaştırıldığında kabul edilebilir sınırlar içindedir.A, B, C, D, E, G genotiplerini içeren genotip panelindeki tüm örnekler yeni testle saptanmıştır. Ancak genotip B ve C içeren panel üyelerinde beklenen değerin yaklaşık iki logaritma altında kantitatif sonuçlar elde edilmiştir. Bu sorunun nedeni tez süresi sonlandığından aydınlatılamamıştır. Ülkemizdeki çalışmalarda sadece genotip D saptanmaktadır. Bu nedenle yeni testin genotip B ve C'deki kısmi kantitasyon sorununun rutin hizmette soruna yol açmayacağı varsayılabilir.Doğruluk çalışmasında 2007 HBV DNA dış kalite kontrol panelinin (QCMD, İngiltere) yeni testle çalışılması ile elde edilen sonuçlar, beklenen değerlerle uyumlu olarak saptanmıştır (R2 = 0.92).Ticari testle HBV DNA pozitif saptanan 180 adet, HBV DNA negatif saptanan 80 adet plazma örneği yeni testle de çalışılmıştır ve her iki test arasındaki uyum değerlendirilmiştir. Kalitatif değerlendirmede, ticari test altın standart olarak alındığında yeni testin duyarlılığı % 99, özğüllüğü % 94 olarak saptanmıştır. Her iki testle de HBV DNA pozitif saptanan örneklerde iki testin uyumu lineer regresyon analizi ile değerlendirilmiş, aralarında güçlü ve anlamlı bir korelasyon olduğu saptanmıştır (r= 0.86, p=0.000, R2= 0.74).Yalancı pozitiflik olasılığını değerlendirmek için HCV RNA pozitif, HBsAg negatif 26 örnek yeni test ile çalışılmıştır. Tümü HBV DNA negatif saptanmıştır.Maliyet analizine göre yeni test, ticari teste göre, test başına 45 TL daha ucuzdur. Laboratuvarımızda yılda yaklaşık 1500 HBV DNA testi yapıldığı göz önüne alındığında, yeni testin rutinde kullanılması durumunda elde edilecek yararın yaklaşık 67500 TL/yıl olacağı hesaplanmıştır.Sonuç olarak, gerçek zamanlı PZT yöntemini kullanan, internal kontrol içeren kantitatif bir HBV DNA testi geliştirilmiştir. Testin duyarlılık, özgüllük, tekrarlanabilirilik ve doğruluk çalışmalarında elde edilen başarılı sonuçlar ve taşıdığı maliyet avantajı, rutinde kullanıma uygun olduğunu göstermiştir.