Kollajenazların lokal aktivitelerinin belirlenmesi amacıyla "hücre in situ kollajen zimografi" yönteminin geliştirilmesi

Savaş E. G., Keleş Bartık D., Oktay G.

TBS International Biochemistry Congress, İzmir, Türkiye, 26 - 30 Ekim 2022, ss.50

  • Yayın Türü: Bildiri / Özet Bildiri
  • Basıldığı Şehir: İzmir
  • Basıldığı Ülke: Türkiye
  • Sayfa Sayıları: ss.50
  • Dokuz Eylül Üniversitesi Adresli: Evet

Özet

Kollajenazlar (MMP-1,-8,-13) matriks metalloproteinazlar ailesine ait olan enzimlerdir ve tümör invazyonu ve metastazında önemli roller üstlenirler. Kollajenazların analizinde kollajen jel zimografi ve in situ zimografi kullanılmaktadır. Kollajenazların lokal aktivitelerinin in vitro belirlenmesi için mevcut olan in situ yöntemler yeterli değildir. Bu çalışmada “hücre in situ kollajen zimografi” yönteminin geliştirilmesi amaçlanmıştır. 8505C anaplastik tiroid kanser hücreleri öncelikle çinko, metanol ve etanol ile fikse edildi ve fiksatiflerin hücre tutunumlarına olan etkileri incelendi. Farklı oranlarda tip-1 kollajen/ floresans işaretli tip-1 kollajen içeren jel karışımları ile 96 kuyucuklu plakada 3 farklı jel modeli oluşturuldu. Bu modeller; hücre altta- jel karışımı üstte, jel karışımı altta- hücre üstte ve hücre iki farklı jel karışımının arasında (sandviç) olarak belirlendi. Kullanılan fiksatiflerin floresans sinyal yoğunluğuna olan etkileri oluşturulan kollajen jeller üzerinde incelendi ve sandviç model uygun olarak belirlendi. Belirlenen modelde tip-1 kollajen: floresans işaretli tip-1 kollajen oranı 2:1 olarak uygulandı. Çinko ve etanol fiksasyonuna kıyasla metanol fiksasyonu ile tiroid kanser hücre tutunumunun ve floresans yoğunluğunun arttığı gözlendi. Geliştirdiğimiz sandviç modelde iki ince kollajen jel tabakası arasında meydana gelen protein çökelmesine dayalı fiksasyonda hücrelerin ve floresans sinyalin daha iyi korunduğunu gözledik. Sonuç olarak çalışmamızda in vitro kullanılabilecek “hücre in situ kollajen zimografi” yöntemini 96 kuyucuklu plakaya adapte ederek geliştirdik.

Collagenases (MMP-1,-8,-13) are enzymes belonging to the family of matrix metalloproteinases and play significant roles in tumor invasion and metastasis. Collagen gel zymography and in situ zymography are used in the analysis of collagenases. Existing in situmethods are not sufficient for in vitro determination of local activities of collagenases. In this study, it was aimed to develop the "cell in situ collagen zymography" method. 8505C anaplastic thyroid cancer cells were first fixed with zinc, methanol and ethanol, and the effects of fixatives on cell adhesion were investigated. Three different gel models were formed in a 96-well plate with gel mixtures containing type-1 collagen/ fluorescent-labeled type-1 collagen with different ratios. These models are: cell on bottom- gel mixture on top, gel mixture on bottom- cell on top and cell between two different gel mixtures (sandwich). The effects of the fixatives used on the fluorescence signal intensity were examined on the formed collagen gels and the sandwich model was determined as appropriate. In this model, the ratio of type-1 collagen: fluorescent-labeled type-1 collagen was applied as 2:1. We observed that thyroid cancer cell adhesion and fluorescence intensity increased with methanol fixation compared to zinc and ethanol fixation. In the sandwich model we developed, we observed that the cells and fluorescence signal were better preserved in the fixation based on protein precipitation between two thin collagen gel layers. Consequently, we developed the “cell in situ collagen zymography” method that can be used in vitro by adapting it to a 96-well plate.