Sessiz tümör süpresör gen mutasyonlarının mrna işlenmesi üzerine olası etkilerinin minigene splicing assay ile saptanması


Creative Commons License

Altungöz O.

4. Uluslararası Katılımlı Hücre Ölümü Araştırma Derneği Kongresi, 17 - 19 Mart 2022, ss.75-76

  • Yayın Türü: Bildiri / Özet Bildiri
  • Sayfa Sayıları: ss.75-76
  • Dokuz Eylül Üniversitesi Adresli: Evet

Özet

Giriş: Ökaryotik genlerin transkript ürünleri öncü bir mRNA (pre-mRNA) olarak sentezlenir ve ‘Alternative splicing’ ile genelde tek pre-mRNA’dan çok sayıda olgun-mRNA oluşturulur. Pre-mRNA’nın işlenmesinde klasik 5’-3’ kesim motifleri ile birlikte diğer cis-etkili splicing düzenleyici elementler olan ‘exonic veya intronic splicing enhancer ve silencer’ motiflerinin (Exonic Splicing Enhancer / Silencer: ESE/ESS; Intronic Splicing Enhencer / Silencer: ISE-ISS) rolü büyüktür. Bu cis-etkili Splicing düzenleyici motifler trans-etkili proteinlerin özgül bağlanma domainleridir ve bu motiflerde oluşan mutasyonlar hatalı mRNA’lara veya pre-mRNA’nın tamamen yıkımına neden olur. Kanser türlerinde splicing mutasyonları ve anormal splice varyantları daha fazla görülür. Bu çalışmada tümör süpresör genlerin (TSG) ESE veya ESS dizilerini bozan sessiz mutasyonların da tümör süpresörlerin fonksiyonlarını bozabileceğinden yola çıkarak bu durumun hücre bölünmesi kontrolünü bozabileceği, hasarlı hücrelerin kontrollü ölümden kaçarak çoğalabileceği ve sonuçta kansere evrilebileceğini öngördük.

Gereç ve Yöntem: COSMIC (Catalogue of somatic mutations in cancer) veri tabanında kanser hücrelerinde belirlenmiş sessiz TSG mutasyonlarını taradık ve bu mutasyonları Human Splicing Finder biyoinformatik analiz sisteminde test ettik. Analiz sonucu beş faklı TSG’de sekiz farklı sessiz ekzonik mutasyonu (CDKN2A: c.273G>A, c.339G>T, c.342C>G; TP53: c.793C>T, c.801G>T; BAI3: c.1419C>T; CABLES2: c.1002C>T; PTCH2: c.249A>G) seçtik. Beş gene ait normal ekzon dizileri (CDKN2A: Ekzon2, TP53: Ekzon8, BAI3: Ekzon8, CABLES2: Ekzon8 ve PTCH2: Ekzon2) kontrol gurubunu oluşturmak üzere 'minigene-splicing assay' sisteminde kullanılan bir ekzon tutuklama vektörü olan pET01plazmidi içerisine paketledik. Site-directed mutagenesis (SDM) protokolü ile sekiz mutant-plazmid’i oluşturduk. Kontrol ve mutant plazmidlerini HeLa hücreleri içerisine transfekte ettik ve mutasyonların mRNA işlemlenmesi üzerindeki etkilerini cDNA'ların dizi analizi sonuçları üzerinden değerlendirdik.

Sonuç: Seçtiğimiz sekiz TSG mutasyonunun 'minigene splicing assay' sonuçları, hiçbir mutasyonun mRNA işlenmesini bozmadığını göstermektedir. Dolayısıyla bu sekiz mutasyon da yolcu (passenger) mutasyon gibi görünmektedir.

Tartışma: Deneysel sonuçların biyoinformatik analiz sonuçları ile uyumlu olmadığı saptanmıştır. Bu durum biyoinformatik tahmin araçlarının geliştirilmeye muhtaç olduklarına işaret etmektedir. Bizim çalışmamız ve benzer deneysel çalışma sonuçları bu tarz araçların geliştirilmesine katkı sunacaktır. Ayrıca, elde edilmesi imkânsız veya zor olan dokularda var olduğu bilinen mutasyonların mRNA işlemlenmesi üzerine etkisinin analizinde 'minigene-splicing assay' sisteminin kullanımı faydalı bir model olabilir.

Background: The transcript products of eukaryotic genes are synthesized as a precursor mRNA (pre-mRNA), and alternative splicing produces various mature-mRNAs from a single pre-mRNA. Classical 5'-3' splice-side motifs as well as exonic/intronic splicing enhancer and silencer motifs (ESE/ESS and ISE/ISS), which are other cis-acting splicing regulatory elements (SRE), plays a major role in the processing of pre-mRNA. These cis-acting SRE motifs are specific binding domains for trans-acting proteins, and mutations in these sequences can lead to aberrant mRNA sequence or complete destruction of pre-mRNA. Splicing mutations and aberrant splice variant have commonly observed in cancers. In this study, based on the notion that silent mutations altering the ESE or ESS sequences in a tumor suppressor gene (TSG) may impair the tumor suppressor function; we hypothesized that this condition would disturb cell division control, allowing damaged cells to evade apoptosis and in turn eventually evolve into cancer.

Materials and Methods: We screened silent mutations of TSG identified for cancer cells in COSMIC database and analyzed these mutations using Human Splicing Finder bioinformatics tool. According to the results optained by bioinformatictools, we selected eight different silent exonic mutations in five different TSG (CDKN2A: c.273G>A, c.339G>T, c.342C>G; TP53: c.793C>T, c.801G>T; BAI3: c.1419C>T; CABLES2: c.1002C>T; PTCH2: c.249A>G). We cloned the reference exon sequences of five genes (CDKN2A: Exon2, TP53: Exon8, BAI3: Exon8, CABLES2: Exon8, and PTCH2: Exon2) into plasmid pET01, an exon trapping vector system used in the minigene-splicing assay to obtain the control group. Using the site-directed mutagenesis, we created eight mutant plasmids for described genes. Mutated and non-mutated plasmids were separately transfected into HeLa cells and the effects of mutations on mRNA splicing patterns were evaluated based on cDNA sequencing results.

Results: cDNA sequencing results showed that none of the sequence variations altered mRNA splicing transcript. Thus, these variations observed in tumors appear to be passenger mutations.

Discussion: Our experimental data were discordant with bioinformatic results. This suggests that bioinformatic tools for splice site prediction need to be improved. Our study, as well as other related studies, may help to improve these bioinformatic tools for splice site prediction. In addition, the use of the 'minigene-splicing assay' system can be a useful model in the analysis of the effect of known mutations on mRNA processing in tissues that are impossible or difficult to obtain.