Akademik Veri Yönetim Sistemi
Diril M. K. (Yürütücü)
TÜBİTAK Projesi, 2015 - 2017
Hepatosellüler karsinom (HCC), en sık görülen primer karaciğer kanseri türüdür. Tedavi seçenekleri sınırlı ve tanı sonrası uzun süre hayatta kalma şansı düşüktür. Bu nedenle, daha iyi, koruma, tanı koyma ve tedavi yöntemlerine acilen ihtiyaç duyulmaktadır. HCC üzerine araştırma yapmak için fare modelleri yaygın olarak kullanılmasına rağmen, bu hayvanlarda tümör oluşumu çok uzun sürmekte ve insana ait tümörlerin özellikleri yeterince korunamamaktadır. İnsanlarda görülen karaciğer tümörlerini farelerde modellemeye yarayacak etkili yöntemlere ihtiyaç vardır. Bu araştırma projesinin amacı, deney hayvanlarının kuyruk toplardamarlarından, CRISPR/CAS9 hedeflemeli genom değiştirici sisteminin enjekte edilmesi yöntemiyle, genetik arka planı insandakilere çok benzeyen tümörlerin oluşturulmasıdır.
Deney fareleri kullanılarak yapılması planlanan bu araştırma projesi, insanlarda görülen karaciğer kanserlerinin, genetik arka yapısı tamamiyle aynı kalacak şekilde, model farelerde üretilebilmesini hedeflemektedir. Her bir tümör diğerinden genetik arka plan olarak farklı olabilmektedir. Tümörü oluşturan tüm hücrelerin ortak özelliği, p53 gibi tümör süpresör genlerinin ve/veya yolaklarının etkisizleştirilmiş olması ve Ras, myc gibi hücre çoğalmasını güden onkogenlerin ve/veya yolakların etkinleştirilmiş olmalarıdır. Bunlara ek olarak apoptoz, hücresel senesans, anjiyongenez vb. işlevleri yöneten gen ve yolaklarda anormallikler yaygındır. Hangi genler ve yolakların nasıl değiştiğine göre, tümör hücrelerinin farklı kemoterapi ilaçlarından farklı şekilde etkilendikleri bilinmektedir.
Bu araştırma projesinin kısa vadeli amacı, deney hayvanlarının kuyruk toplardamarlarından, CRISPR/Cas9 hedeflemeli genom değiştirici sisteminin enjekte edilmesi yöntemiyle hepatosellüler karsinomların hızlıca oluşturulabileceğini göstermektir. Bu bakımdan bu proje hipotezin kanıtlanması (proof of principle) çalışması olarak görülebilir ve gelecekte yapmayı planladığım benzer çalışmalar için referans oluşturacaktır.
Bu projenin uzun vadedeki asıl amacı, hastalardan biyopsi yöntemiyle alınan karaciğer tümörlerinin genetik profillerinin analiz edilerek tümör hücrelerinin uğradığı mutasyonların belirlenmesi, arka plandaki bu mutasyonları aynı olan tümörlerin deney farelerinde oluşturulması ve bunların farklı kemoterapi ilaçlarının etkisinin test edilmesinde kullanılabilmesidir. Böylelikle, tedavi amaçlı kullanılacak ilaçların etkili olup olmayacağı kısa zamanda farelerde ön test edilebilecektir.
Farelerin kuyruk toplardamarından onkogenik plazmidlerin enjekte edilmesi yöntemiyle hepatosellüler karsinomların oluşturulması geçmişte başarıyla uygulamış olduğumuz bir tekniktir. CRISPR/Cas9 genom mühendisliğinin kullanımı giderek artmakta ve yeni uygulama alanları keşfedilmektedir. Bu iki tekniğin eş zamanlı olarak kullanımıyla hepatositlerde kalıcı genom değişikliklerinin yapılabilirliği literatürde gösterilmiştir.
Burada sonuç raporu verilen araştırma projesi, etkisi kanıtlanmış iki yöntemin (hidrodinamik kuyruk toplardamarı enjeksiyonu ve CRISPR/Cas9 genom hedeflemesi) kullanılmasıyla fare hepatositlerinde tümör ve kanser oluşumuna neden olacak genom değişikliklerinin oluşturulmasını hedeflemektedir. Yapılan literatür taramaları, proje öneri aşamasındayken benzeri bir çalışmanın henüz yapılmadığını göstermekteydi. Dolayısıyla bu araştırma projesinin alanında ilk çalışma olması ve gelecekteki çalışmalara referans oluşturması beklenmekteydi. Ancak proje değerlendirme aşamasındayken, benzeri bir çalışmaya ilişkin bilimsel makale yayımlanmıştır (Xue et al., 2014). Proje devam ederken yine benzeri çalışmalar yayınlanmıştır (Liu et al., 2017). Bu çalışmalarda, CRISPR/Cas9 ve hidrodinamik kuyruk toplardamarı enjeksiyonu teknikleri kullanılarak p53 ve Pten genlerinde knockout yapılmış ve ß-catenin geninde bir nokta mutasyonu yapılarak ß-catenin proteininin nükleer lokalizasyonu sağlanmıştır. Yapılan bu genomik müdahaleler sonucunda karaciğerde neoplasilerin oluştuğu, ancak bunun transpozon yöntemine nazaran daha uzun sürdüğü gösterilmiştir.
· Xue W, Chen S, Yin H, Tammela T, Papagiannakopoulos T, Joshi NS, Cai W, Yang G, Bronson R, Crowley DG, Zhang F, Anderson DG, Sharp PA, Jacks T. CRISPR-mediated direct mutation of cancer genes in the mouse liver. Nature. 2014 Oct 16;514(7522):380-4. doi: 10.1038/nature13589.
Liu Y, Qi X, Zeng Z, Wang L, Wang J, Zhang T, Xu
Q, Shen C, Zhou G, Yang S, Chen X, Lu F. CRISPR/Cas9-mediated p53 and Pten dual
mutation accelerates hepatocarcinogenesis in adult hepatitis B virus transgenic
mice. Sci Rep. 2017 Jun 5;7(1):2796. doi: 10.1038/s41598-017-03070-8.