Jingmen Tick Virus'un Bazı Evcil Memeli ve Olası Vektör Kene Türlerinde Moleküler Yöntem ile Araştırılması

Yükseköğretim Kurumları Destekli Proje, 2023 - 2025

Proje Türü: Yükseköğretim Kurumları Destekli Proje
Başlama Tarihi: Mayıs 2023
Bitiş Tarihi: Mayıs 2025

Proje Özeti

Hayvan yetiştiriciliğinde hayvan refahına uygun olmayan bakım, besleme ve barınma koşulları, ektoparaziter mücadelenin tam anlamıyla yapılmaması, kontrolsüz gerçekleştirilen hayvan hareketleri ve bilinçsiz yetiştiriciler ile buna ek olarak değişkenlik gösteren iklim koşulları, göçmen kuş hareketliliği ve yaban hayvanlarının sürekli gözlem ve kontrol altında tutulmaması gibi nedenlere bağlı olarak Türkiye’deki kene popülasyon yoğunluğu oldukça yüksek seviyelerdedir. Kene popülasyon yoğunluğunun yüksek olması, kenelerin insan ve hayvanlar ile karşılaşma ihtimalini de bir hayli arttırmaktadır. Bu nedenlere bağlı olarak da insan ve hayvanlarda kene enfestasyonunun önüne geçilememektedir.

Keneler, birçok virusun mekanik veya biyolojik olarak insan ve hayvanlara bulaşmasına neden olarak çeşitli hastalıklara yol açmaktadır. Kene kaynaklı virusların meydana getirdiği hastalıklar, insan ve hayvan sağlığını önemli ölçüde etkileyerek ciddi halk sağlığı tehditleri oluşturmaktadır. Öyle ki her yıl küresel anlamda binlerce insan ve hayvan kene kaynaklı viral hastalıklar yüzünden mevcut yaşam kalitesi azalmakta, engelli kalmakta veya hayatını kaybetmektedir. Kene kaynaklı viral hastalıklar bunun yanında ekonomiye de ciddi zararlar vermektedir. Öyle ki devletler tarafından her yıl kene kaynaklı viral hastalıklara yakalanan insan ve hayvanların tedavisi için yüksek miktarlarda bütçeler ayrılmak zorunda kalınmaktadır. Kene kaynaklı viral hastalıklar ayrıca çeşitli ürünleri için üretilen hayvanlardan elde edilecek verim miktarlarında ciddi azalmalara yol açarak da ülke ekonomisine ciddi zararlar vermektedir.

Kene kaynaklı viruslar arasında yer alan Jingmen tick virus ((JMTV; Jingmen kene virusu (JKV)), Flaviviridae ailesindeki Flavivirus genusunda sınıflandırılmamış Flavivirus grubu içerisinde yer almakta olup; 30-100 nm arasında bir boyuta sahip, tek iplikçikli, pozitif polariteli, dört segmentli ve zarflı bir RNA virusudur.

Bu çalışma kapsamında, Türkiye’nin değişik bölgelerinde kenelerin aktif olduğu Mart-Ekim ayları arasında kene enfestasyonuna sahip farklı ırk, yaş ve cinsiyetteki; sığır, koyun ve keçilerin her birinden ayrı ayrı toplanan 100 adet olmak üzere toplamda 300 adet kene ve kan örneğinde homojenizasyon ve ekstraksiyon işlemlerini takiben JKV varlığının RT-PCR yöntemi ile araştırılması planlanmaktadır.

Kan ve kene örneklerinin toplanması işleminde her hayvandan alınan kan numunesi EDTA içeren 10 ml’lik antikoagülanlı ayrı bir tüpe ve her hayvandan örneklenen keneler ise ayrı bir steril ve herhangi bir koruyucu madde içermeyen 1,5 ml’lik eppendorf tüplere konulacaktır. Hedef hayvanlardan örneklenecek kan numuneleri asepsi/antisepsi kuralları uygulanarak steril bir kanül ile vena jugularis isimli toplardamardan alınacaktır. Örnekleme yapılan hayvanların kulak numarası, ırkı, yaşı, cinsiyeti, gebelik durumu, barınak koşulları, yayılıma çıktığı bölge, endoparaziter tedavi yapılıp yapılmadığı ve ne zamandan beri o işletmede bulunduğu gibi bilgiler de kayıt altına alınacaktır.

Kan ve kene örnekleri, içerisine birkaç adet buz aküsü yerleştirilmiş temiz strafor kutular ile soğuk zincir ve genel numune taşıma kurallarına uygun bir şekilde Burdur Mehmet Akif Ersoy Üniversitesi Veteriner Fakültesi Viroloji ABD Laboratuvarı’na nakledilecektir.

Kan örnekleri, 2000 rpm’de 10 dk süre ile santrifüj edilecektir. Santrifüj sonrası tüp içerisinde ayrı bir şeklide görülebilen lökosit tabakası, içerisinde 1 ml 2500 U/ml Penisilin ve 20 mg/ml Streptomisin ihtiva eden fosfat tamponlu tuz solüsyonu (PBS) bulunan steril tüplere aktarılacak ve 2000 rpm’de 10 dk süre ile tekrar santrifüj edilerek lökosit yıkama işlemine tabi tutulacaktır. Bu işlem 3 defa tekrarlanacaktır. Son yıkamada elde edilen lökosit tabakası, içerisinde 1 ml antibiyotikli PBS bulunan steril stok tüpüne aktarılacak ve bir sonraki işleme kadar da -80°C’de muhafaza edilecektir.

Kene örneklerinin, tür ve cinsiyet tayinleri ışık mikroskobu aracılığıyla morfolojik yapıları dikkate alınarak yapılacaktır. Tür ve cinsiyet tayini yapılan keneler tür, cinsiyet ve örneklendiği bölge baz alınarak en fazla 10’arlı gruplara ayrılıp, yeni steril ve koruyucu madde içermeyen eppendorf tüpler içerisine konulacaktır ve bir sonraki işleme kadar -80°C’de muhafaza edilecektir.

Kene örnekleri, homojenizasyon işlemi için -80°C’den çıkartılıp her kene havuzu için ayrı hazırlanmış steril ve DNaz/RNaz free bir tüp içerisine aktarılacaktır. Bu tüpün üzerine belirli bir miktarda sıvı azot dökülecektir. Sıvı azot ile dondurulan keneler DNaz/RNaz free pestiller yardımı ile iyice ezilerek çok küçük parçalar haline getirilecektir. Ezme işlemini takiben bu tüpler 1500 x g'de 10 dakika santrifüj edilecek ve üstte kalan berrak sıvı alınarak bir sonraki işleme kadar -20°C’de muhafaza edilecektir.

Hazırlanan kan ve kene homojenatlarından viral RNA eldesi için, ticari ekstraksiyon kiti kullanılacaktır. İzolasyon işlemi kit prosedüründe belirtildiği gibi yapılacaktır.

Elde edilen kan ve kene ekstraktlardan, revers transkripsiyon işlemi ile komplementer DNA (cDNA) sentezi gerçekleştirilecektir. Bu işlem için ticari kit kullanılacaktır. Sentez kit prospektüsündeki kurallara uygun bir şekilde gerçekleştirilecektir.

Toplanan kan ve kene örneklerinde JKV etkeninin aranması amacıyla yapılan bu çalışmada, kullanılacak konvansiyonel RT-PZR yöntemi ve JKV etkenine uygun primerler için daha önce yapılan çalışmalar referans alınacaktır.

Konvansiyonel RT-PZR amplifikasyonu tamamlandıktan sonra elde edilen ürünler ethidyum bromid ile hazırlanmış %1’lik agaroz jelde yürütülerek ürün büyüklüğü izlenecektir. Agaroz jel ve tank tamponu için Tris/Borate/EDTA (TBE) solüsyonu kullanılacaktır. Tank boyutuna uygun olarak %1’lik agaroz jel için; 0,5xTBE tampon solüsyonundan 50 ml alınıp, tartımı yapılan 0,5 g agaroz ile karıştırılarak mikrodalgada ısıtılacaktır. Homojenize olduğundan emin olunduğunda ethidyum bromid (0,5 µg/ml) eklenerek birkaç tur karıştırılacaktır. Bu işlemden sonra jel, taşıyıcısına dökülecek ve jelin donması beklenecektir. Donan jel, taşıyıcısı ile birlikte elektroforez tankına yerleştirilecektir. Her RT-PZR ürününden 6 µl alınıp 1 µl yükleme solüsyonu ile pipete edildikten sonra jel üzerinde açılan boş kuyucuklara yüklenecektir. Ürün büyüklüğünün belirlenmesi için 1 µl DNA merdiveni en baştaki kuyucuğa yüklenecektir. Daha sonra elektrik akımı (8 volt/cm) altında 25 dakika süre ile yürütülen RT-PZR ürünleri, elektroforez tankından çıkarılıp UV görüntüleme cihazında incelenecektir. Pozitif olarak tespit edilen ürünler dizi analizine gönderilecektir.

UV görüntüleme sonucunda pozitif olduğu saptanan örnekler, dizin analizi için hizmet alımı kapsamında ticari bir firmaya gönderilecektir. Dizi analizi sonrasında elde edilen ham veriler, National Center Biotechnology Information (NCBI) servisinin sunmuş olduğu BLASTn ve BLASTp programları ile nükleotid ve aminoasit dizilimi yönünden incelenecektir. Elde edilen veriler daha sonra nükleotid ve amino asit benzerlik/farklılık yönünden Clustal W programı ile karşılaştırılacaktır. Ayrıca elde edilen diziler, Mega 6 programından yararlanılarak gen kitaplığında yer alan diğer dizinler ile filogenetik ağaç oluşturulacak ve virusların orijinleri ile ilgili oluşan tablo değerlendirilecektir.