Akademik Veri Yönetim Sistemi
Yıldırım Y.(Yürütücü), Nayir M. B.
Yükseköğretim Kurumları Destekli Proje, 2023 - 2025
Hayvan yetiştiriciliğinde hayvan refahına
uygun olmayan bakım, besleme ve barınma koşulları, ektoparaziter mücadelenin
tam anlamıyla yapılmaması, kontrolsüz gerçekleştirilen hayvan hareketleri ve
bilinçsiz yetiştiriciler ile buna ek olarak değişkenlik gösteren iklim
koşulları, göçmen kuş hareketliliği ve yaban hayvanlarının sürekli gözlem ve
kontrol altında tutulmaması gibi nedenlere bağlı olarak Türkiye’deki kene
popülasyon yoğunluğu oldukça yüksek seviyelerdedir. Kene popülasyon
yoğunluğunun yüksek olması, kenelerin insan ve hayvanlar ile karşılaşma
ihtimalini de bir hayli arttırmaktadır. Bu nedenlere bağlı olarak da insan ve
hayvanlarda kene enfestasyonunun önüne geçilememektedir. Keneler, birçok virusun mekanik veya
biyolojik olarak insan ve hayvanlara bulaşmasına neden olarak çeşitli
hastalıklara yol açmaktadır. Kene kaynaklı virusların meydana getirdiği
hastalıklar, insan ve hayvan sağlığını önemli ölçüde etkileyerek ciddi halk
sağlığı tehditleri oluşturmaktadır. Öyle ki her yıl küresel anlamda binlerce
insan ve hayvan kene kaynaklı viral hastalıklar yüzünden mevcut yaşam kalitesi
azalmakta, engelli kalmakta veya hayatını kaybetmektedir. Kene kaynaklı viral
hastalıklar bunun yanında ekonomiye de ciddi zararlar vermektedir. Öyle ki
devletler tarafından her yıl kene kaynaklı viral hastalıklara yakalanan insan
ve hayvanların tedavisi için yüksek miktarlarda bütçeler ayrılmak zorunda
kalınmaktadır. Kene kaynaklı viral hastalıklar ayrıca çeşitli ürünleri için
üretilen hayvanlardan elde edilecek verim miktarlarında ciddi azalmalara yol
açarak da ülke ekonomisine ciddi zararlar vermektedir. Kene kaynaklı viruslar arasında yer alan Jingmen
tick virus ((JMTV; Jingmen kene virusu (JKV)), Flaviviridae
ailesindeki Flavivirus genusunda sınıflandırılmamış Flavivirus grubu içerisinde
yer almakta olup; 30-100 nm arasında bir boyuta sahip, tek iplikçikli, pozitif
polariteli, dört segmentli ve zarflı bir RNA virusudur. Bu çalışma kapsamında, Türkiye’nin değişik
bölgelerinde kenelerin aktif olduğu Mart-Ekim ayları arasında kene
enfestasyonuna sahip farklı ırk, yaş ve cinsiyetteki; sığır, koyun ve keçilerin
her birinden ayrı ayrı toplanan 100 adet olmak üzere toplamda 300 adet kene ve
kan örneğinde homojenizasyon ve ekstraksiyon işlemlerini takiben JKV varlığının
RT-PCR yöntemi ile araştırılması planlanmaktadır. Kan ve kene örneklerinin toplanması
işleminde her hayvandan alınan kan numunesi EDTA içeren 10 ml’lik
antikoagülanlı ayrı bir tüpe ve her hayvandan örneklenen keneler ise ayrı bir
steril ve herhangi bir koruyucu madde içermeyen 1,5 ml’lik eppendorf tüplere
konulacaktır. Hedef hayvanlardan örneklenecek kan numuneleri asepsi/antisepsi
kuralları uygulanarak steril bir kanül ile vena jugularis isimli
toplardamardan alınacaktır. Örnekleme yapılan hayvanların kulak numarası, ırkı,
yaşı, cinsiyeti, gebelik durumu, barınak koşulları, yayılıma çıktığı bölge,
endoparaziter tedavi yapılıp yapılmadığı ve ne zamandan beri o işletmede
bulunduğu gibi bilgiler de kayıt altına alınacaktır. Kan ve kene örnekleri, içerisine birkaç
adet buz aküsü yerleştirilmiş temiz strafor kutular ile soğuk zincir ve genel
numune taşıma kurallarına uygun bir şekilde Burdur Mehmet Akif Ersoy
Üniversitesi Veteriner Fakültesi Viroloji ABD Laboratuvarı’na nakledilecektir. Kan örnekleri, 2000 rpm’de 10 dk süre ile
santrifüj edilecektir. Santrifüj sonrası tüp içerisinde ayrı bir şeklide
görülebilen lökosit tabakası, içerisinde 1 ml 2500 U/ml Penisilin ve 20 mg/ml
Streptomisin ihtiva eden fosfat tamponlu tuz solüsyonu (PBS) bulunan steril
tüplere aktarılacak ve 2000 rpm’de 10 dk süre ile tekrar santrifüj edilerek
lökosit yıkama işlemine tabi tutulacaktır. Bu işlem 3 defa tekrarlanacaktır.
Son yıkamada elde edilen lökosit tabakası, içerisinde 1 ml antibiyotikli PBS
bulunan steril stok tüpüne aktarılacak ve bir sonraki işleme kadar da -80°C’de
muhafaza edilecektir. Kene örneklerinin, tür ve cinsiyet
tayinleri ışık mikroskobu aracılığıyla morfolojik yapıları dikkate alınarak
yapılacaktır. Tür ve cinsiyet tayini yapılan keneler tür, cinsiyet ve
örneklendiği bölge baz alınarak en fazla 10’arlı gruplara ayrılıp, yeni steril
ve koruyucu madde içermeyen eppendorf tüpler içerisine konulacaktır ve bir
sonraki işleme kadar -80°C’de muhafaza edilecektir. Kene örnekleri, homojenizasyon işlemi için
-80°C’den çıkartılıp her kene havuzu için ayrı hazırlanmış steril ve DNaz/RNaz
free bir tüp içerisine aktarılacaktır. Bu tüpün üzerine belirli bir miktarda
sıvı azot dökülecektir. Sıvı azot ile dondurulan keneler DNaz/RNaz free
pestiller yardımı ile iyice ezilerek çok küçük parçalar haline getirilecektir.
Ezme işlemini takiben bu tüpler 1500 x g'de 10 dakika santrifüj edilecek ve
üstte kalan berrak sıvı alınarak bir sonraki işleme kadar -20°C’de muhafaza
edilecektir. Hazırlanan kan ve kene homojenatlarından
viral RNA eldesi için, ticari ekstraksiyon kiti kullanılacaktır. İzolasyon
işlemi kit prosedüründe belirtildiği gibi yapılacaktır. Elde edilen kan ve kene ekstraktlardan,
revers transkripsiyon işlemi ile komplementer DNA (cDNA) sentezi
gerçekleştirilecektir. Bu işlem için ticari kit kullanılacaktır. Sentez kit
prospektüsündeki kurallara uygun bir şekilde gerçekleştirilecektir. Toplanan kan ve kene örneklerinde JKV
etkeninin aranması amacıyla yapılan bu çalışmada, kullanılacak konvansiyonel
RT-PZR yöntemi ve JKV etkenine uygun primerler için daha önce yapılan
çalışmalar referans alınacaktır. Konvansiyonel RT-PZR amplifikasyonu
tamamlandıktan sonra elde edilen ürünler ethidyum bromid ile hazırlanmış %1’lik
agaroz jelde yürütülerek ürün büyüklüğü izlenecektir. Agaroz jel ve tank
tamponu için Tris/Borate/EDTA (TBE) solüsyonu kullanılacaktır. Tank boyutuna
uygun olarak %1’lik agaroz jel için; 0,5xTBE tampon solüsyonundan 50 ml alınıp,
tartımı yapılan 0,5 g agaroz ile karıştırılarak mikrodalgada ısıtılacaktır.
Homojenize olduğundan emin olunduğunda ethidyum bromid (0,5 µg/ml) eklenerek
birkaç tur karıştırılacaktır. Bu işlemden sonra jel, taşıyıcısına dökülecek ve
jelin donması beklenecektir. Donan jel, taşıyıcısı ile birlikte elektroforez
tankına yerleştirilecektir. Her RT-PZR ürününden 6 µl alınıp 1 µl yükleme
solüsyonu ile pipete edildikten sonra jel üzerinde açılan boş kuyucuklara
yüklenecektir. Ürün büyüklüğünün belirlenmesi için 1 µl DNA merdiveni en
baştaki kuyucuğa yüklenecektir. Daha sonra elektrik akımı (8 volt/cm) altında
25 dakika süre ile yürütülen RT-PZR ürünleri, elektroforez tankından çıkarılıp
UV görüntüleme cihazında incelenecektir. Pozitif olarak tespit edilen ürünler
dizi analizine gönderilecektir. UV görüntüleme sonucunda pozitif olduğu
saptanan örnekler, dizin analizi için hizmet alımı kapsamında ticari bir
firmaya gönderilecektir. Dizi analizi sonrasında elde edilen ham veriler,
National Center Biotechnology Information (NCBI) servisinin sunmuş olduğu
BLASTn ve BLASTp programları ile nükleotid ve aminoasit dizilimi yönünden
incelenecektir. Elde edilen veriler daha sonra nükleotid ve amino asit
benzerlik/farklılık yönünden Clustal W programı ile karşılaştırılacaktır.
Ayrıca elde edilen diziler, Mega 6 programından yararlanılarak gen kitaplığında
yer alan diğer dizinler ile filogenetik ağaç oluşturulacak ve virusların
orijinleri ile ilgili oluşan tablo değerlendirilecektir.